增殖性玻璃体视网膜病变基因治疗的研究进展 2008年01月24日

　　增殖性玻璃体视网膜病变(prolife vitreoretinopthy，PVR)是裂孔性视网膜脱离、糖尿病视网膜病变和玻璃体出血等眼底疾病的严重并发症，也是造成许多眼底疾病继续恶化,视力丧失的重要原因。近30年来玻璃体手术虽然快速发展,PVR的治疗治疗效果仍不尽如人意。随着对PVR病因学认识的深入和近年来分子生物学的快速进展及其在医学中的广泛应用，应用基因治疗是近年来发展较快的一种PVR治疗方法，基本已形成一套完整的技术理论体系，并于1990年由Blease等第一次用于治疗严重联合免疫缺陷病(SCZD)病人获得成功后，一系列临床试验开展了起来[1] 。

1． PVR形成机制
　　增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是发生于视网膜脱离后的一种过度创伤修复反应，其中有多种炎性因子、细胞因子和细胞的参与，它们之间相互影响、相互作用，构成一个复杂的网络系统，共同参与了PVR的发生和发展[2，3]。其确切发病机制尚未完全明确，主要病理特点是细胞增生行成具有收缩作用的膜，牵引视网膜脱离。参与的细胞有视网膜上皮细胞（RPE）、神经胶质细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、肌纤维母细胞，后两者可由RPE转化而来。概括有以下几点：（1）视网膜及其周围组织损伤，如裂伤、外伤等；（2）血-视网膜屏障破坏，血源性细胞因子（如PDGF、bFGF、EGF、VEGF等）、活性物质及炎性介质（如IL-1、IL-2、IL-12、TNF、TGF等）进入玻璃体；（3）巨噬细胞及淋巴细胞进入、激活、吞噬与分泌；（4）某些抗原的暴露，如S抗原；（5）RPE等细胞在多种因子作用下激活、移行、表型转换并分泌，在较早阶段可有癌基因水平的调节；（6）RPE细胞、巨噬细胞对抗原的提呈作用；（7）RPE细胞在内外源因子作用下增生，产生细胞外基质（如纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）[4]；（8）细胞收缩及增生膜改建牵引视网膜脱离。因此体内体外有关PVR的非手术治疗主要是针对细胞增生。

2． 基因治疗PVR
　　基因治疗的广义概念就是说将新的遗传物质转移至某个个体的体细胞内，从而对该个体产生治疗效果。
2．1 PVR基因治疗的特点
　　PVR基因治疗具有眼部基因治疗的一般特点[5，6]：（1）由于眼球结构相对封闭．易于基因转移的相对精确定位。（2）眼内结构在活体内可借助检眼镜直接观察，从而易于判断疗效。（3）由于有血-眼屏障，有利于载体在体内达到一定的有效浓度，同时使眼处于相对免疫赦免状态。PVR基因治疗还有其特殊点：不需要转导基因永久表达，而只要杀死玻璃体腔内的增殖细胞即可。
2．2 基因治疗的载体
　　基因治疗的效果在很大程度上取决于载体系统。基因治疗的载体可分为两大类：病毒系统和非病毒系统。
2．2．1 病毒性载体 包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、疱疹病毒等。逆转录病毒能将外源基因稳定地插入到靶细胞中，且感染率高，此外遗传背景清楚，易于改造和操作，且有一整套检测系统，故临床应用最为广泛。腺病毒有较大宿主范围，感染细胞时不整合到宿主染色体中，潜在的致癌危险小[7],且容易制备高滴度病毒粒子，可以达到1011pfu/m1,目前已进入临床实验阶段。腺相关病毒能将外源基因定点整合到宿主细胞上，具有特异性。痘苗病毒可感染静息期细胞，外源基因整合容量大；疱疹病毒具有嗜神经性，可用作神经系统靶向的良好载体。
2．2．2 非病毒性载体 目前常用的有脂质体、裸DNA、DNA包裹颗粒、多聚阳离子型载体等。它们都能进行自我复制，无免疫原性，可重复使用，但组织特异性和靶向性差，转染效率低。
2．3、PVR基因治疗中基因转移的途径和方法
　　为了使目的基因进入体内靶细胞发挥作用，必须解决两个问题：（1）如何使目的基因进入患者体内，即基因转移的途径。（2）如何使目的基因进入靶细胞内，即基因转移的方法。
2．3．1 基因转移的途径[8，9]
　　导人基因的方式有两种：一种是回体转移（ex vivo)，即在体外将基因导人细胞内，再将这种基因修饰的细胞回输入病人体内，使这种带有外源性基因的细胞在体内表达，从而达到治疗目的；另一种是活体直接转移（in vivo)，即将外源基因直接导入人体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。回体转移比较经典、安全、效果易控制，但步骤多，技术复杂，不易推广；活体直接转移简便，易推广，是基因转移研究的方向，但只有活体直接转移基因的方法成熟了，基因治疗才能真正走向临床。
2．3．2 基因转移的方法
　　包括基因转移的方法有物理法、化学法和生物法。
物理法[8]，即用电击、显微注射等方法将外源基因导人靶细胞内。此种方法由于效率低、所携带遗传物质易被细胞内DNA酶降解及不易应用于体内等缺点而很少使用。
　　化学法[8]，主要有DNA磷酸钙沉淀法、染色体介导法和脂质体包埋等。目前日益受到广泛注意的主要为脂质体包埋法。它主要是通过脂质体与细胞膜融合的方式而将包埋于脂质体的外源基因导入靶细胞内。其最大优点在于能应用于活体，转移效率也较高，而且不受重组DNA分子大小的限制，又无使用病毒载体所存在的插入突变、野生病毒污染等问题。其最大缺点在于表达时间过短。
生物学方法，主要是使用各种病毒载体将外源基因导入靶细胞。眼内基因治疗中常用的病毒载体有：①逆转录病毒载体[8]：方法比较复杂．需经2次转导2次选择。但转移的效率比较高，转入的基因一般是单拷贝、单位点整合，很少发生重排现象，是目前基因治疗中应用最广泛的一种载体。它主要用于有丝分裂细胞的转染，是PVR基因治疗中的重要载体。②单纯疮疹病毒(1型)载体[4,6]：其滴度可高达1010pfu/m1。它可转染几乎所有的细胞类型，对神经元细胞包括感光细胞都有很好的亲和性，而且可以逃避宿主的免疫反应。但体内转染后仅表达几天，且有一定的神经毒性。③腺病毒载体[10]：不能与宿主DNA整合，在宿主染色体外复制，尤其适用于大基因片段的转染。该病毒可产生很高的滴度(病毒颗粒1011pfu/m1)。其中整合腺病毒载体在眼转基因中研究最广，可转染许多细胞类型。④腺病毒相关病毒载体：由于此种载体在人类中无毒性及免疫反应较少等优点而比腺病毒载体更有吸引力。此外，还有慢病毒载体等在眼内转基因中应用也较广泛。
2．4 PVR基因治疗的策略
　　为了达到有效的治愈疾病的目的，必须针对不同的病因采取不同的措施。目前基因治疗常用的策略有:①基因置换：就是把致病基因整个地用正常基因代替，这是理想和真正意义上的基因治疗。②基因修正：就是将致病基因的突变碱基顺序加以改变，而正常部分子以保留。这是最为理想的途径。③基因修饰：就是将带有功能的目的基因导人原发病灶的细胞或导入其他类型的相关细胞，利用目的基因的表达产物治疗疾病而致病基因并未得到改变。与前两种策略相比，基因修饰较易实现，是目前基因治疗中广泛使用的方法。但由于目的基因不是原位导入的，所以其表达和调控均难以取得理想的结果。④基因封闭：就是利用反义技术特异性地封闭某些有害基因的表达。⑤基因抑制：就是导人外源基因以抑制原有的基因，其目的在于阻断某些有害基因的表达。
因PVR主要是由于细胞过度增生所致，目前PVR基因治疗中所采用的策略主要是：(1)通过基因修饰导入增殖抑制基因而抑制细胞增殖。（2）通过反义技术封闭促细胞生长的基因而抑制细胞增殖。
2．5 PVR 基因治疗的方法及实验研究现状
2．5．1 玻璃体腔内直接转移基因抑制细胞的增殖 tK基因是编码脱氧胸苷激酶的基因，又称“自杀基因”。其治疗PVR 的基本原理是利用单纯疱疹病毒(HSV)的胸腺嘧啶核苷酸酶将某些抗病毒药物如丙氧鸟苷(GCV)作为底物使之磷酸化，这种磷酸化产物不仅可以阻断转染细胞的DNA合成使之死亡，而且可通过“旁观者效应”杀死周边未转染HSV-tk基因的细胞，而达到抑制细胞增殖的目的。Sakamoto[11]等在实验性PVR动物模型玻璃体腔中注入HSV-tk阳性的兔成纤维细胞和GCV可显著降低PVR的发生率及严重程度。同时发现只要玻璃体中HSV-tk阳性细胞达到10%即可通过旁观者效应显著抑制PVR，而对视网膜无毒性。Murata[12] 等和Stout[13]等都发现直接向动物玻璃体中注射逆转录病毒载体，尽管其转染效率很低，只有2%左右，但仍能通过很强的旁观者效应阻止PVR的发展。至于“旁观者效应”的机制可能是由于细胞间存在着相互联系的通道，使信息从被修饰的细胞转到未被修饰的细胞而导致末被修饰的细胞死亡。这个效应又使人提出是否HSV-tk阳性细胞会对正常的视网膜产生毒性作用。但到目前为止，尚未发现有任何毒性作用：这可能是由于细胞间的直接接触或吞噬活性是旁观者效应必需的缘故。而很多注入玻璃体的细胞没有直接和视网膜直接接触，并且视网膜细胞吞噬作用较弱。
　　Kimura[14]等利用含有HSV-tk基因的逆转录病毒上清液与成纤维细胞一起注入玻璃体腔中，在给予丙氧鸟苷后成纤维细胞增殖受到明显的抑制，这种抑制是针对外源性具有增殖特性的成纤维细胞，与PVR的实际临床行为尚存在一定差距。
　　为更接近临床实际，万光明[15]等用lacZ基因作为报告基因将逆转录病毒转染的PA317细胞注入已行成视网膜增生膜的PVR动物模型玻璃体腔中，结果表明基因在玻璃体增生膜上至少表达30天以上，同时未见视网膜组织有报告基因表达，光镜及电镜亦未发现对正常的视网膜有毒性作用。证明逆转录病毒用于PVR的基因治疗具有靶向性，为以后用目的基因（如自杀基因）直接体内基因治疗PVR提供实验依据。
　　除转染“自杀基因”以外，Bali[16]等将IL-10基因转移至兔皮肤纤维细胞中，然后注入至兔玻璃体中发现可抑制细胞的增殖。Ikuno[17]等用变异的PDGF受体基因载体阻断PDGF的自分泌环路治疗PVR。
2．5．2 反义核酸技术抑制玻璃体内细胞的增殖 随着分子生物学技术的深入发展,反义技术成为疾病治疗的一个新方向。1984年Lzant首次提出(反义核酸技术)的概念。反义核酸是指依据碱基互补原则，能与靶基因或mRNA结合的RNA或RNA片段。反义核酸导入细胞后可抑制相应靶基因或mRNA的复制、转录、剪切、翻译和表达，降低细胞内靶基因表达的蛋白质的含量，它具有高度的选择性和亲和性。王琳[18]等研究表明,培养的RPE增生细胞核抗原(PCNA)和凋亡基因BCL-2都成高水平表达,同时反义BCL-2对RPE细胞增殖无明显影响,而反义PCNA在6.25umol.L-1作用3天可抑制RPE生长,成剂量依赖性。
　　陈建斌[19]等用针对鼠PCNA序列的ASODN作用于体外培养的兔RPE细胞,在1.12对细胞生长的抑制率是81.1%,同样浓度SODN也有21%的抑制率,提示在较高浓度下可能存在非特异性细胞生长抑制作用,尚有待研究。王文莹[20]等用E1区缺失的缺陷型重组腺病毒为载体,上游插入增强目的基因表达的巨细胞病毒(CMV)启动子联合胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和5-氟胞嘧啶(5-FC)共同构成(Ad CMV CD/5-FC)治疗系统作用于体外培养的hRPE,结果显示转染了CD基因的hRPE细胞在暴露于5-FC后出现自杀现象,细胞存活率随腺病毒滴度和5-FC浓度增加而降低,说明此系统对hRPE细胞生长有显著的抑制效果,且未显示明显的旁观者效应。CD基因本身对正常和增殖细胞无毒副作用,它将无毒性的5-FC转化为有细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-Fu)而导致被转染的细胞被杀伤。
　　反义核酸的种类：反义核酸主要有三种：①反义寡聚核苷酸(0DNs)：是指能与特定mRNA或DNA序列互补的含有15—20个核苷酸的DNA片段。其合成方便,序列设计简单并容易修饰。②反义RNA：是指能与mRNA互补的RNA分子。其能与mRNA分子特异性互补结合从而抑制该mRNA分子的加工和翻译。③核酶(ribozye)：是近年来新近发现的一种具有酶活性的能特异性水解核酸分子的一种小分子核酸。反义核酸的来源有三：①人工合成寡聚核苷酸，多用于ODNs。②用重组DNA技术构建表达载体在体内转录反义核酸．多用于反义mRNA 。③利用诱生物诱生体内的反义核酸。反义核酸的转移载体：①脂质体：为提高细胞摄取率,目前多采用阳离子脂质体，如 Lipofectin,它与ODNs共用可明显增加细胞对ODNs的摄取率。②HJV-脂质体-反义核酸复合物：为近年来新采用的载体。灭活的HJV能够明显提高组织细胞对脂质体包封的反义核酸的摄取率。
　　反义核酸防治PVR的基因：①有关转录因子：有些转录因子控制着有关细胞生长基因的表达，封闭这些因子有可能抑制细胞的增殖。②生长因子基因：生长因子与受体结合是细胞生长增殖信息传递的第一步。目前PVR中己发现多种生长因子：PDGF、TGF—ß、FGF、EGF等，通过抑制这些生长因子的作用可抑制细胞的增殖。③癌基因：细胞生长增殖信息传送入细胞核后要作用于一些癌基因myc，myb，fos,jun等，这些癌基因的表达产物在信息传递通路的不同阶段起作用，一旦表达异常,细胞生长即受到明显影响。
　　反义核疗治疗PVR的现状：目前利用反义核酸治疗PVR大多处于体外实验阶段，尚未见体内试验的报道。但反义核酸在抑制肿瘤及其他增生性疾病中的显著效果提示利用反义核酸治疗PVR应是一条潜在的可行的道路。

3． PVR基因治疗存在的问题及前景展望
　　目前PVR的基因治疗的实验研究取得了显著的效果，展示了基因治疗PVR的良好前景。但PVR的确切发病机制尚未明了,要真正应用于临床．尚有一些关键问题需要解决：①必须更进一步深入研究PVR发病的分子机制，找出关键致病因子；②基因体内转染效率太低，今后需加强研究提高转染效率的方法；③对反义核酸，一方面要增加其穿透力和与靶序列亲和力，同时要延长反义核酸在体内的半衰期。④安全性问题,目前仍不能完全排除基因载体本身及外源基因整合到宿主染色体带来的一系列不良反应
基因治疗是一种新的治疗方法，由于一些技术问题，现在还不能用于临床。相信随着基因治疗研究的不断深入,并结合其它治疗措施,PVR的基因治疗将日趋成熟,为患者带来福音。

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