蛋白激酶C与糖尿病性视网膜病变 2008年01月24日

　　糖尿病性视网膜病变（DR）发病机制的研究目前已取得较大进展并已深入到分子水平，除以往已比较明确的高血糖对组织的毒性作用、多元醇-肌醇代谢异常、血液动力学障碍、蛋白质的非酶促糖基化等，近年来还注意到内皮素-1、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、肝细胞生长因子、粘附分子等均与DR的发生有密切关系。上述各种细胞间信息分子在视网膜上均有其相应的生物信号感受装置（特异受体），靶细胞接受刺激后借助细胞信息系统进行信号转导，引起相关基因表达水平的改变，最终导致新生血管形成和DR的一系列病理改变。蛋白激酶C（PKC）是磷脂酰肌醇代谢应答细胞所接受刺激的中心环节，和细胞生长、增殖、分化等密切相关，本文就近年来对PKC在DR发病机制中的研究做一综述。

1. PKC的分类和结构
　　蛋白质磷酸化和去磷酸化是真核细胞信号传导的基本机制之一，而蛋白激酶（PK）则是这个过程中催化磷酸化的一组重要蛋白。其中依赖Ca2＋／磷脂（PL）的蛋白激酶即蛋白激酶C，是目前发现的最大的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，广泛分布于人和动物组织、特别是哺乳类细胞中，以无活性的形式存在于胞液内。
　　迄今至少已发现并克隆了12种亚型的PKC，组成PKC家族[1]。按其对Ca2＋和甘油二酯（DG）的依赖性不同又可分为三组[2]。第一组称为经典PKC（classic PKC，cPKC），由α、β1／β2及γ组成，激活需要Ca2＋和DG；第二组称为新PKC（novel PKC，nPKC），由δ、ε、η及θ组成，激活时不需要Ca2＋，但需要DG；第三组称为非典型PKC（atypical PKC，aPKC），由ξ、λ及τ组成，激活时不需要Ca2＋和DG，而需I（1,4,5）P3激活。新近又通过克隆和序列分析发现了“第四组”（the fourth group）PKC，包括μ和ν两种亚型[1]。
　　每个亚型PKC分子均由一条多肽链组成，分子量约77KD。蛋白分子C-末端的亲水结构域是酶的催化部位，N-末端的疏水结构域是酶的调节部位[1,3]，有Ca2＋、甘油二酯（DG）、佛波酯、磷脂酰丝氨酸（PS）的结合位点。多肽链又可分为若干保守区（C1～C4）和可变区（V1～V5），其中C3区为ATP结合区。nPKC和aPKC缺C2区，即Ca2＋结合区，故这二类PKC不依赖于Ca2＋。aPKC还缺乏部分富含半胱氨酸区，这一结构可与磷酸及DG结合，因此aPKC的激活剂不需要Ca2＋也不需要DG[2]。

2. PKC在细胞信号系统中的作用
　　细胞信号传递系统实际上是由一系列蛋白质所组成，包括：特异受体；G蛋白（存在于细胞膜）；产生第二信使的酶蛋白（效应器蛋白）；蛋白激酶；靶功能蛋白质；调节蛋白等。
　　PKC属于“IP3、DG信号系统”，其信号转导的步骤大致如下：胞外信息分子与相应靶细胞质膜G蛋白偶联性受体结合，使G蛋白αq、α11、α15或α16活化，从而使磷脂酶C（PI-PLC）β活化，作用于膜内侧4,5-二磷酰磷脂酰肌醇（PIP2）使之水解即生成1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）及DG，两者均为重要的第二信使。IP3从质膜进入胞浆后，即与内质网膜及线粒体膜上的特异受体结合，导致Ca2＋通道开放，引起胞浆内Ca2＋瞬时增高，活化钙结合蛋白；此外IP3还可以进一步磷酸化成为1,3,4,5-四磷酸肌醇（IP4），参与打开细胞膜上的Ca2＋通道，使胞外Ca2＋进入细胞，从而引起胞浆内Ca2＋浓度较为持久的增高。而DG的作用则在于激活PKC。所有PKC亚型都存在于胞浆中，受刺激后可逆地转位到膜上，在膜中与PS、DG、Ca2＋形成复合物而活化，PKC:PS:DG:Ca2＋为1:4:1:1。
PKC激活后可磷酸化特定的底物蛋白质产生所谓短期效应，还可引起基因表达、细胞增殖、细胞分化等所谓长期效应——它的活化可引起癌基因c-fos和c-jun的表达，Fos和Jun蛋白经磷酸化修饰后能与DNA增强子结合，从而刺激其他基因的转录和表达，因此PKC在细胞增殖分裂信号传递中具有重要作用。不同的PKC亚型在细胞信号转导中的作用各不相同，同一PKC亚型对不同细胞产生的作用也各异。PKC本身在完成底物磷酸化后，可被Ca2＋依赖性中性蛋白酶作用于其V3区而被降解。

3. PKC激活在糖尿病性视网膜病变发生中的作用
　　DR的发生和发展是一个长期过程，初期在组织病理上出现视网膜毛细血管周细胞凋亡、消失[4]，伴随内皮细胞丢失而形成无细胞性毛细血管[5]，随后的细胞增殖则导致临床可见的微血管瘤、新生血管等[5,6]。上述病理过程中，还有血液流变学异常[6,7,8]、纤溶-凝血机制失调[7,8]以及白细胞功能异常[9]等诸多因素共同参与。病变后的视网膜功能异常包括：血流减少[10]、血-视网膜屏障破坏[11]、电生理特性改变[12]以及适应局部代谢需要而对毛细血管灌注进行自身调节的机制丧失[13]等。大量研究已证实有多种细胞因子、血管活性物质以及组织、细胞自身因素等介导了高血糖对视网膜的损伤，而PKC则广泛参与到这些细胞信号的传递过程之中，分述如下。
3.1、PKC与内皮素-1
　　内皮素-1（ET-1）是一种内皮细胞来源的促血管因子，具有明显的血管收缩效应，体内有三种不同的特异性受体ET-A、ET-B、ET-C。有关内皮素及其受体的详细结构已有深入研究，相关基因也已克隆[14-17]。ET-1在眼内组织广泛分布[18]，既是神经调节因子，同时也是重要的自分泌和旁分泌生长因子[19,20]，在DR发病机制中的作用已被普遍公认[12,21]。
　　大量研究证实，糖尿病患者及动物模型的血浆和视网膜内ET-1水平明显升高[18,22,23]，由于尚未发现细胞内有ET-1的储备机制，其含量变化被认为是基因转录直接调节的结果[19,20]。已知高血糖是诱导ET-1分泌的最主要的代谢因素[24]，而葡萄糖的大部分效应则由PKC活化介导 [21]。葡萄糖可诱导PKC-α、β1、β2和δ激活，而引起ET-1表达增加的主要是β和δ亚型[21]。PKC诱导ET-1表达的机制可能是通过活化蛋白1（activated protein 1，AP-1）位点而增强ET-1转录[21]。人类PPET-1基因的5／端有一8核苷酸序列的佛波酯应答元件，同时也是fos jun复合物（AP-1）的结合部位[25]，Lee M-E等[26]用c-fos和c-jun质粒协同转染显著提高了牛内皮细胞ET-1的转录水平，Soh JW等[27]用PKC-α和ε瞬时转染NIH 3T3细胞激活了c-fos启动子的血浆应答元件。以上事实表明，PKC转导的细胞内信号可通过转录因子fos和jun的反式作用，直接调节人类PPET-1基因的表达[21]。
　　此外，PKC的活化还可能顺次激活MAP激酶，后者则可诱导c-fos、c-jun和ET-1的转录速率[21]。另一方面，ET-1对PKC亦有调节作用：它参与AP-1调节位点的诱导，后者可顺次激活PKC[28]；还可易化PKC从胞浆到质膜的转位效应并增加甘油二酯的合成[29,30]。
3.2、PKC与血管内皮生长因子
　　在糖尿病时，血管内皮生长因子（VEGF）由视网膜色素上皮细胞、神经节细胞、müller细胞、周细胞及平滑肌细胞等产生[31,32]。其在体内有5种异构体，均以二硫键连接的二聚体形式存在且都具备诱导增殖和血管生成的效应[12]。VEGF有两种高亲和力受体，均为受体酪氨酸蛋白激酶 [33,34]，受体表达局限于血管内皮[12]。 VEGF与其受体结合后，通过受体的蛋白激酶活性，至少可以磷酸化11种具有SH2结构域的蛋白质，磷脂酶C-γ便是其中之一，后者活化后使膜PIP2生成IP3和DG，继而激活PKC[35]。VEGF具有促血管生成和促细胞分裂的效应，作用于DR的增殖阶段，同时也可作为“通透性因子”而作用于DR的早期阶段，造成血-视网膜屏障功能的破坏[31,32,36,37]。
　　VEGF被认为是视网膜新生血管形成的一个主要因素[38]，关于视网膜中VEGF水平升高和新生血管发生的关系已被反复论证[36,39-41]。Aiello LP[43]和Robinson GS[44]等在缺血性视网膜病变的大鼠模型中，采用VEGF拮抗剂仅能抑制50％的视网膜新生血管形成，其他作用机制的抑制剂也不能获得超过50％的抑制效应[45,46]。Pu X等发现[47]：VEGF的促细胞分裂活性主要由PKC-β介导，用β亚型特异的抑制剂LY333531或特异的反意寡核苷酸可阻断上述效应。Hiroaki O等[48] 也发现，在鼠缺血性视网膜病变模型，通过口服选择性激酶抑制剂PKC412，阻断由VEGF受体和某些PKC亚型所致的磷酸化效应，可能完全抑制视网膜新生血管。该作者通过一步研究得出结论[38]：尽管有其它生长因子参与，但VEGF的信号转导在视网膜新生血管发生中仍居关键性地位，对VEGF受体激酶活性的抑制可以完全阻断视网膜新生血管，这将成为治疗增殖性视网膜病变和其他缺血性视网膜病变的有效途径。
　　VEGF还被称为“血管通透性因子”（vasopermeability factor，VPF），其增加表皮微血管通透性的效应较组胺强5万倍[49,50]。Aiello LP等[37]发现：玻璃体内注射VEGF后很快便引起视网膜血管渗漏，对该视网膜组织的免疫杂交分析表明有PKC-α、β2、δ转位到质膜并活化，进一步用特异性β亚型抑制剂可近乎完全地抑制由VEGF诱导的血管渗漏，从而证实了VEGF主要通过PKC-β的信号转导引起屏障功能破坏。
VEGF和ET-1之间也存在交互作用 [51,52]：VEGF增加内皮细胞中PPET-1的mRNA及蛋白的表达，而ET-1和 ET-3也可通过依赖PKC的机制增加VEGF的分泌。在DR初期，高血糖诱导ET-1分泌增加，引起缺血缺氧和随之而来的VEGF分泌，ET-1引起平滑肌细胞增殖，VEGF则引起内皮细胞增殖和血管渗漏，两者共同参与DR的发生与发展。
3.3 PKC与胰岛素样生长因子-1
　　胰岛素样生长因子-1（IGF-1）为70氨基酸残基的多肽，其序列与胰岛素有高度同源性[12]，视网膜内多种细胞均可合成，包括微血管内皮细胞、周细胞、色素上皮细胞等[53]。其受体属于受体酪氨酸激酶，通过活化磷脂酶Cγ而激活PKC[12]。IGF-1可诱导PKC-η、ε和ξ转位到质膜并调节胞浆内β亚型水平，抑制PKC活性则可阻断IGF-1诱导的DNA合成、细胞迁移及IGFBR-5基因的表达，该基因为IGF-1的转录模板[54]。在很多增殖型糖尿病性视网膜病变（PDR）患者的血清和玻璃体内均发现IGF-1含量升高[55]。IGF-1可充当抗凋亡因子，并对活体和离体的内皮细胞均有直接的促分裂效应，包括内皮增生、趋化增强和血管生成等[55]，这些都是通过PKC和PI3激酶等信号通路实现的。VEGF同样能刺激内皮细胞增生，但它是通过激活PKC-β，而IGF-1则是通过激活非β的其他PKC亚型[55]。
　　DeBosch BJ等[55]证实IGF-1还能刺激培养的视网膜内皮细胞对葡萄糖的摄取，其信号转导由PKC-β和PI3激酶完成，但两条通路并非平行作用，PKC处于信息传递的下游。由于VEGF同样能刺激内皮细胞摄取葡糖糖，两者的作用程度相似且都涉及PKC-β的激活，因此推测：IGF-1也和VEGF一样，并非通过提高细胞内总的葡萄糖载体数量，而是使胞浆内的载体转移到质膜而使葡萄糖摄取得以增加[55,56]。细胞内过多的葡萄糖会对靶细胞造成伤害，Knott RM等[57]已证实：过多的葡萄糖进入可使牛视网膜内皮细胞DNA合成减少，细胞损伤将触发增殖和分化潜能，随之而来的便是新生血管形成。
3.4 PKC与肝细胞生长因子
　　肝细胞生长因子（HGF）是一种间充质来源的多效性蛋白质因子，在多种组织细胞中发挥有丝分裂原、运动因子、成形素等功能，是体内有效的血管生成因子。HGF受体（属于受体酪氨酸激酶）为c-Met原癌基因的产物，已发现其表达于视网膜内皮细胞[58]。合并PDR的糖尿病患者其血清和玻璃体内HGF水平较非糖尿病者明显升高，而PDR进展期患者又较PDR静止期者高[59,60]。Cai W等[58]发现：HGF能以剂量-效应和时间-效应的形式非常有效地刺激内皮细胞生长和迁移（这是血管生成反应的两个重要方面），而且HGF在视网膜局部的浓度可比玻璃体中更高，其效应也就更明显。
　　HGF与其受体结合后MAP激酶的磷酸化、PI3激酶和PKC活性的立即增高使其生物学效应得以实现。MAP激酶的磷酸化作用快速、显著、持久，在HGF信号的传递中起重要作用，而PI3激酶和PKC处于信号通路的上游，它们至少在部分程度上是平行作用[58]。HGF诱导内皮细胞生长的效应可被bFGF加强，但后者不能单独启动这一过程。HGF还可能通过诱导VEGF增多而发挥作用，但其起始效应与VEGF无关，因此它在视网膜新生血管形成中仍被认为是重要的独力效应因子[58]。
3.5 PKC与其他病理过程
　　DR时视网膜血管功能的改变几乎都涉及到血管细胞的相互作用，提示糖尿病可能破坏了微循环系统中的细胞间通讯，缝隙连接即是其中的一种重要方式。Hidebiro O等[61]使用神经生物素（一种能通过缝隙连接扩散的示踪剂）对新鲜视网膜微血管组织进行研究后发现：大鼠视网膜微血管中广泛存在细胞-细胞偶联，实验所见的示踪剂从周细胞到其他微血管细胞扩散的现象，与电镜下所见的中枢神经系统中存在于周细胞与内皮细胞间的缝隙连接相吻合[62]。而随着糖尿病模型的建立，该细胞间通讯网络迅速关闭，示踪剂扩散停止，加以胰岛素治疗6-8天后又可恢复其扩散。作者分析其机制是由于葡萄糖诱导的PKC活化，因为PKC激活剂豆蔻酸佛波酰乙酯（PMA）可明显减少示踪剂扩散，甚至使之局限在被标记的周细胞内，表明PKC参与了细胞间缝隙连接的关闭。上述细胞间通讯的紊乱，不仅破坏了维持正常血流和血管通透性等所必需的细胞间联系通路，而且使血管周细胞处于“代谢孤立”状态，从而造成周细胞死亡和相应的功能障碍。
　　白细胞在DR中的作用也日益受到关注。组织学研究提示：由于糖尿病时白细胞活性增强[63]，氧化自由基产生增多[64]，不仅引起血管阻塞，还可损伤内皮细胞，引起血-视网膜屏障破坏、血管渗漏[65]。此外，视网膜缺氧和新生血管形成均与白细胞陷夹于视网膜微血管内有关[66]。白细胞引起血液流变学异常，除因其变形性降低，细胞变得僵硬、体积增大外[67]，更重要的是其对视网膜血管内皮细胞的粘附性增强，其中涉及到两种粘附分子：细胞内粘附分子-1（ICAM-1）和血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1），糖尿病时白细胞数量增加伴随着两种粘附分子表达增多，这一过程有PKC的参与[65]：已证实PKC活化可上调ICAM-1在人脐静脉内皮细胞的表达和白细胞对内皮的粘附[68]， 而VCAM-1在脐静脉内皮的表达同样由PKC所介导[69]，阻断PKC活性即可抑制葡萄糖诱导的白细胞粘附[70]。另外，由于PKC活化可引起微血管收缩，故使用PKC抑制剂能改善视网膜的低灌注状态，使血流增加、微循环中切变应力增大，从而减少淤滞的白细胞数量[71]。
　　从以上分析可以看出：PKC作为细胞信号转导中的重要成分广泛参与了DR发生发展的诸多过程，许多目前已知的细胞因子和病理过程均在PKC的介导下发挥作用，其中PKC-β的作用尤其重要。这一发现提示我们：抑制PKC活性正成为治疗DR的一条有效途径，也将为DR的防治开辟一个新的领域。今后还将进一步研究PKC的详细作用机制及其与其它信号转导通路的相互作用，以及使用PKC抑制剂的安全性、有效性问题。

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