晶状体再生的进展 2008年01月24日

　　白内障是世界范围内主要的致盲眼病，目前对白内障的治疗主要是白内障切除加人工晶状体植入。术后可出现后囊混浊等并发症，并且人工晶体为异物，有时可引起不同程度的排异反应。现国外学者已开始研,究晶状体再生，即在晶状体切除后，使眼内的非晶状体细胞转分化为晶状体细胞和晶状体纤维，从而形成一个正常的晶状体［１］。再生晶状体是自体组织，相容性好，避免了上述并发症，由于儿童的后囊混浊发生率很高，并且，儿童的晶状体再生能力强，所以晶状体再生尤其适用于儿童，是治疗白内障极具开发潜力的一种方法。本文将从晶状体再生的组织来源、培养基的选择、再生过程中的基因、因子的表达、以及其他影响晶状体再生进程的因素作一综述。
1、晶状体再生的细胞来源
　　晶状体再生主要局限于一些有尾目的动物，一些鱼类也能再生其晶状体。对小鸡而言晶状体再生也是有可能的，但必须是在其发育过程中的一段非常窄的时期。在再生过程中，晶状体可起源于多种组织，如：虹膜色素上皮（IPE），角膜内层上皮和角膜周上皮，也有极少数可起源于视网膜神经层（NR）、视网膜色素层（PR）和其他。在这些组织中只有角膜组织的起源和通常晶状体的发生是相同的，而IPE和NR（PR）均是视泡的衍生物。从细胞谱系来看，这三种组织都完全不应是晶状体的来源，因此晶状体的再生并非晶状体个体发育的简单重复［2］。
1．1、虹膜上皮
　　在体内实验中，晶状体切除后，背侧的虹膜色素上皮开始增殖，然后通过脱色素颗粒而去分化，这种现象最主要发生在背侧虹膜的瞳孔区，并导致胞浆区扩大，出现广泛的细胞外空间，因此实验组背侧虹膜与对照眼相比明显疏松。腹侧虹膜也同样有此改变但没有背侧虹膜明显，而且其与晶状体再生无关［3,4］。晶体切除后10d，背侧虹膜细胞已完全脱色素并形成一去分化的晶状体泡，14～16d，这些细胞开始转分化成晶状体上皮细胞和晶状体纤维细胞，大约在晶状体切除后25d该晶状体泡就形成了一完整的晶状体，有特定的晶状体上皮覆盖大量晶状体纤维，并有着正常的极性［6,7］。Kodama等［8］在细胞体外培养的试验中获悉来自视杯的任何色素上皮细胞都能转分化成晶状体细胞，从而形成典型的晶状体样小体。这种能力并没有物种的限制，甚至来自成人虹膜的色素上皮细胞也具有此能力。
　　腹侧虹膜上皮细胞或来自腹侧虹膜的组织在体外培养，通过一定的时间其也能分化为晶状体。显然在细胞培养过程中，细胞间的通讯、细胞的表面都遭到了一定的破坏，这种破坏对去分化的启动有很重要的作用。而且Ito等通过实验证明在体内腹侧虹膜上皮细胞事实上能抑制背侧虹膜PE细胞的去分化。Ito也证明PE去分化转分化为晶状体并非一定要在眼内才能发生，当分离的PE细胞植入再生晶状体的原生质后，可形成一具有准确前后极性的晶状体［9］。这就表明在体内而非体外，存在着空间限制性。这种限制提示了在虹膜的背侧－腹侧轴上，一定存在着特定的调控。试验表明有两个同源异型盒基因在背侧虹膜上特异性表达：Pax-6[10]，Prox-1[11]。这种特异性表达对色素细胞的再生能力起很大的调控作用。
1．2、外层角膜上皮
　　有爪蟾蜍的晶状体再生来源于与晶状体个体发育有着共同起源的角膜组织。外层角膜上皮的细胞分化方向由视网膜释放的因子来控制。晶状体切除后，这些因子到达角膜，从而使外层角膜上皮细胞转分化为晶状体细胞。Bosco等［12］通过体外试验得出：当有爪蟾蜍幼虫的角膜外层在有视网膜神经层的培养基中培养时，其表现的纤维细胞分化与晶状体的个体发育和晶状体再生具有相同的细胞生物学变化。
2 培养基
　　体外晶状体再生的培养基大致有以下几种：EF
　　培养基：由Eagle’s MEM，8%的胎牛血清（FBS）,2mmol•L-1的L-谷氨酰胺和26 mmol•L-1碳酸氢钠组成；EdF培养基：Eagle’s MEM, 8%的透析FBS,2 mmol•L-1的L-谷氨酰胺和26 mmol•L-1碳酸氢钠组成；EdFP培养基：EdF培养基加上0.5 mmol•L-1的苯硫尿（PTU）；EdFPH培养基：EdFP培养基加上2.5×105U•L-1透明质酸酶（HUase）；EdPA培养基：EdF培养基加上0.15 mmol•L-1的L-抗坏血酸-2磷酸（Asc-2p）；EdFPA培养基：EdFP培养基加上0.15 mmol•L-1 Asc-2p；EdFPHA培养基：EdFPH培养基加上0.15 mmol•L-1 Asc-2p。
　　基因在不同的培养基中，其表达水平各不相同。在EdFPH培养基中，黑素的合成被PTU完全抑制，因此IPE细胞逐渐失去其表现型，该细胞表现出强大的生长潜力。此期细胞似乎没有分化的特异性，去分化的IPE(deIPE)细胞在此期可保持两个月以上。当在培养基中加入Asc-2p后即(EdFPHA培养基)，其可形成典型的晶状体。当未加入Asc-2p时，尽管当时deIPE细胞很多，但晶状体的形成却不能被观察到［13］。当IPE细胞在EF培养基中时，PE细胞特异性基因（MMP115,络氨酸E,TRP-1）的表达很容易被探测到，而当在EdFPH培养基中时，基因的表达水平明显降低,RPE细胞分化的特异性基因pP334mRNA[14],晶状体的特异性α-,β-,γ-晶状体蛋白基因在IPE细胞和deIPE细胞中都不能表达［15］,但当在EdFPHA培养基中时,这些基因可被激活。在晶状体转分化过程中,pax-6基因的转录物在EF培养基中,其表达处于很低水平,而当在EdEPHA培养基中孵育后,其pax-6 mRNA的水平迅速明显上升了。当IPE细胞培养在EdFPA培养基中时,尽管分散的晶状体细胞很多，但其晶状体的结构始终未能察见，当IPE处于EdFA培养基中,并加入bFGF时,IPE细胞快速增长,并可部分形成多细胞层,但这些细胞始终不能转分化成晶状体细胞。
3 晶状体再生过程中的基因及细胞因子的表达
3．1 成纤维细胞生长因子(FGFs)及其受体
　　FGF是体内分布最多的细胞因子之一，有碱性和酸性两大类,两者具有53%的同源性,都有肝素结合位点。bFGF由146个氨基酸组成，去掉N-末端的15个氨基酸残基仍不影响其有丝分裂的作用[16]。bFGF的生物活性比aFGF大100倍。FGF有两类受体：一类是高亲合力受体，属络氨基蛋白激酶类受体，另一类是低亲合力受体，即肝素样受体。bFGF是对广泛来源于中胚层和神经外胚层的细胞，包括内皮细胞的有效促细胞因子，它具有促增殖和趋化作用，并与胚胎发育有关。能刺激各种细胞分裂增殖，能刺激晶状体上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、角膜上皮细胞等的增殖［17］。
　　晶状体的发育过程通过外胚层和视泡之间的接触而被诱导，而FGFs控制着这一诱导过程，同时FGFs决定着晶状体的极性。试验表明FGF-1为眼球中的一种成分，且在前中有着供纤维分化需要的高浓度而在晶状体上皮细胞所在的后房表现为低浓度。事实上FGFs和其受体已证实在眼组织中有表达。FGF-1和FGF-2已被发现在鼠的发育过程中在视网膜的神经层和晶状体细胞中表达，尤其是FGF-1,FGFR-1,FGFR-2，FGFR-3在去分化的细胞、再生的晶状体泡和分化的纤维中有显著的表达［18］。然而，在去分化的过程中，仅有FGFR-1产物特异性的出现在背侧虹膜。试验中加入FGFR-1的抑制剂可抑制晶状体再生和晶状体纤维的分化，这更证实了FGFR-1在调节晶状体再生中的重要性。另外，在转基因的鼠中，外源性FGFs能诱导与晶状体再生中相似的异常情况。这种异常包括：泡型晶体，双晶体，无正常极性的晶状体。FGF这种特殊的信号通路在视网膜、晶状体的发育和再生中都起着重要的作用。以前的实验显示蛋白多糖在再生过程中从背侧虹膜中消失，这种情况很可能和FGFs有关。因为FGFs制约蛋白多糖，并影响FGFs对受体的激活。这方面的研究对了解控制晶状体的去分化和再生过程中的主要细胞的表面改变提供了重要线索。在体外实验中显示FGFs增强晶状体再生的功能与其在体内的功能相一致。
当IPE细胞在培养中加入不同浓度的人类重组bFGF的EdFP培养基中时，结果表明bFGF能提高IPE细胞的生长且成浓度依耐性，但bFGF不能促进IPE细胞的转分化［19］。
3．2 包含同源异型盒的基因（Hox基因）
　　虹膜背腹侧轴的空间调控表明有Hox基因的参与，这些基因在细胞的命运的决定、器官的发生和构建形式等方面都起了重要作用。同样Hox基因也调控着晶状体的再生过程。几种Hox基因在蝾螈眼中的表达已被研究证明，如：Pax-6, Prox-1, Pax-2 ,Six-3, NvHoxA4, NvHox B1, NvHox7, Nvmsx-1, Xbr1等，但最重要的调控者还是Pax-6,Prox-1［20-22］。
3．2．1 Pax-6
　　Pax-6包含一个同源异型盒基因和一个对子盒基因，是一种晶状体诱导基因。Pax-6在成熟蝾螈眼中和晶状体再生过程中均有表达，但在美西螈中没有发现表达。晶状体切除后Pax-6很快就能在外胚层中表达，而且其表达范围大于有分化潜能的能形成晶状体的区域［23］。这些组织在晶状体切除前未探测到Pax-6的表达，但也有少数报导，在正常的角膜中有Pax-6的表达。这可能与探测技术的灵敏性以及RNA转录物的稳定性有关。对于非洲蟾蜍的蝌蚪而言，单纯只有角膜切口既不会有晶状体的形成，也不会有Pax-6的表达。这两种情况要发生就必须同时有角膜切口和晶状体切除，因此推测细胞命运和Pax-6在外部角膜内层的表达由视网膜上的一些因子控制，这些因子只有在晶状体切除后才能到达角膜［24］。
3．2．2 Prox-1
　　Prox-1为晶状体发育过程中的另一种重要的基因，其被发现在成年蝾螈的背侧虹膜和在晶状体再生过程中的背侧虹膜上均有特异性表达［5］。Prox-1在与晶状体分化密切相关的组织中的表达比Pax-6迟，并且其表达范围局限于有Pax表达的晶状体形成区。Prox-1主要在背侧虹膜中测到，这成了在状晶状体再生过程中第一个对背侧虹膜细胞有特异性调控的转录因子。免疫组化表明Prox-1在晶状体再生过程中在背侧瞳孔周虹膜中优先表达，而且其在背侧虹膜中高表达，试验同时表明其在腹侧虹膜中有微量的表达，对晶状体再生过程中的背腹侧轴起调控作用，这表明Prox-1在晶状体再生过程中起着重要的作用。试验显示Prox-1在鸡晶状体细胞的纤维化中有表达，因此Prox-1能调节晶状体蛋白的表达。在背侧去分化的虹膜和再生晶状体中，Prox-1能控制晶状体的特异性调节与分化［25］。
3．3 晶状体蛋白基因
　　对从具有αA-,βB1-晶状体蛋白部分氨基酸序列的非洲蟾蜍晶状体中分离出来的晶状体蛋白序列的比较结果表明，56个中仅有2个，88个中仅有8个氨基酸残基分别是相同的，这可能是由于非洲蟾蜍基因组的四倍体性或是PCR过程中核苷酸的错误结合，或仅仅是个体差异［15］。各种动物的βB1-晶状体蛋白的共同特征是N端具有脯氨酸－丙氨酸（PAPA）序列，此序列被认为在细胞骨架蛋白和／或细胞膜之间的相互联系上起了重要作用［26］。尽管非洲蟾蜍的βB1-晶状体蛋白的N端确实有1个富含脯氨酸和丙氨酸的序列，但并没有典型的PAPA序列［27］。现在的研究表明在晶状体的发育过程中3种晶状体蛋白均是在晶状体基板阶段被同时检测到的，相反它们在晶状体再生过程中开始表达的时间是不同的，αA-,βB1-晶状体蛋白的表达是在晶状体纤维分化之前；而γ-晶状体蛋白基因信号只有在晶状体纤维分化之后才能被检测，这表明角膜外部内层的晶状体再生过程并非晶状体的胚胎发育过程的简单重复［2］。
3．4、其它基因
　　除以上因子基因外，晶状体再生过程中还有其它基因的表达，如：包含LeR-1和VeR-1序列的基因。在角膜晶状体的转分化过程中还有Xotx2,Xsox3.Xprox1,gamma6-cry等基因的表达，但其表达的时间顺序还不清楚［28］。
4 晶状体再生的影响因素
4．1 巨噬细胞的吞噬活性
　　Eguchi在电镜观察后提出背侧边缘的虹膜的脱颗粒主要是由巨噬细胞摄取色素颗粒而引起的［29］。Okamoto报导，在切除晶状体的蝾螈眼内注射亚硫酸镍（αNi3S2）后，可诱导眼内肿瘤，而在鼠中其肿瘤的发生率为100％，当眼内注入大剂量（20g•L-1）αNi3S2时晶状体再生被控制在早期。适中剂量（10 g•L-1）时，在同一眼中，来自背侧虹膜的晶状体再生和来自腹侧虹膜的肿瘤生成均被降低［30］。
　　在正常晶状体的再生过程中，巨噬细胞的吞噬活性在转分化为晶状体细胞的背侧虹膜中很高，而在不能转分化为晶状体细胞的腹侧虹膜细胞中水平低。由此表明巨噬细胞的吞噬活性与晶状体的再生紧密相关。当1μL αNi3S2 （20 g•L-1）注入切除晶状体的蝾螈眼内后晶状体再生被抑制，同时背侧虹膜的巨噬细胞的吞噬活性也明显降低，降到腹侧虹膜和对照组水平。而背侧虹膜积聚的巨噬细胞的数量与腹侧虹膜和对照组相同。这就提示加入致癌物后虹膜色素上皮的脱颗粒程度的降低并非巨噬细胞的消失或数量的减少，而是背侧虹膜的巨噬细胞的吞噬活性的严重降低［31］。
4．2 其它
　　在包括鸡的许多物种中抗坏血酸在房水中的浓度较高，它可刺激各种培养细胞的胶原合成，尽管其在培养系统中的功能还不太清楚，很可能抗坏血酸是通过刺激去分化的IPE细胞的胶原的合成，从而增强晶状体的发生。在摘除晶状体的鼠中腹腔内注射维生素A0.05mL（3×104IU•L-1给幼鼠，5×104IU•L-1给成年鼠），结果表明维生素A可诱导幼鼠和成年鼠的晶状体再生而且再生的晶状体在形状、大小、透明性及组织学特征等方面都与正常晶状体相同。外源性类维生素A对晶状体再生无明显作用，但当视磺酸化合物被戒酒硫抑制或其受体功能被破坏后晶状体再生过程被严重影响。在大多数晶状体再生被抑制的情况下，晶状体的形态学发生将会被损害，少数情况下可出现异位晶状体再生［32］。有爪蟾蜍来自外层角膜的晶状体再生能力随着生长过程而逐渐降低。这可能是由于：视网膜的诱导能力降低；外层角膜的晶体形成能力降低；晶状体状分化过程的抑制；或是三者的结合［33］。因此动物越年轻，其晶状体再生能力越强。
目前，国外学者在晶状体再生体内实验方面已取得了一定的进展，当晶状体切除后，眼内非晶状体细胞可转化为晶状体细胞，并形成一具有正常极性，且形状、大小、透明度及一些组织特征都与正常晶状体相同的再生晶状体；在体外培养中色素细胞都可转分化为晶状体细胞，形成类晶状体样小体。晶状体再生可为晶状体外伤、白内障尤其是儿童白内障的治疗开辟广阔天地。成熟的晶状体再生技术是现代眼科学者努力研究的方向之一。

参考文献
[1] Mitashov VI. Cell source,regulatory factor and gene expression in the regeneration of the crystalline lens and retina in vertebrate animals[J]. Izv Akad Nauk Ser Biol 1996 ; (3): 298 –318.
[2] Mizuno N，Mizuno N, Mochii M, Takahashi TC,Eguchi G, Okada TS. Lens regeneration in Xenopus is not a mere repeat of lens development,with respect to crystalline gene expression[J]. Differentiation 1999;64:143-149.
[3] Eguchi G, Kodama R. Electron Micriscopic studies on lens regeneration ,Ⅰ:mechanism of depigmentation of the iris[J].Embryologa 1963;8: 45-62.
[4] Yamada T. Control mechanisms in cell-type conversion in newt lens regeneration[J].In:Wolsky A,ed.Monogr Dev Biol.Basel 1977;13:11-19.
[5] Del RIO-Tsonis K, Stanislav IT, Tsonis PA. Regulation of Prox 1 during lens regeneration[J]. Invest Ophthalmol VIS SCI 1999;40(9):2039-2045.
[6] Tsonis PA. Regeneration of lens in amphibuians[J]. Result Prob Cell Differ 2000;31:179-196.
[7] Tsonis PA. Regeneration in vertebrate[J]. Developmental Biology 2000;221:273-284.
[8] Kodama R, Eguchi G. From lens regeneration in the newt to in vitro transdifferentiation of vertebarte pigmented epithelial cells[J].Semi Cell Biol 1995; 6:143-149.
[9] Ito M, Hayashi T, Kuroiwa A, Okamoto M. Lens formation by pigmented epthelial cell reaggregate from dorsal iris implanted into limb blastema in the adult newt[J]. Dev Growth Differ 1999;41: 429-440.
[10] Del Rio-Tsonis K, Washahaugh CH, Tsonis PA. Expression of Pax-6 during urodele eye development and lens regeneration[J]. Proc Natl Acad SCI USA 1995;92:5092-5096.
[11] Tomarev SI, Sundin O, Banerjee B, Duncan MK, Yang JM. Piatigorsky J. Chicken homeobox gene Prox-1 related to Drosophila prospero is expressed in the developing lens and retina[J]. Dev Dyn 1996; 206: 354-377.
[12] Bosco L, Testa O, Venturini G, Willems D. Lens fiber transdifferentiation in cultured larval Xenopus leavis out cornea under the influnce of neural retina- conditioned medium [J].Cell Mol Life Sci 1997:53(11-12):921-928.
[13] Kosaka M, Kodama R, Eguchi G. In Vitro Cultrue Systerm for iris-pigmented Epithelial cells for Molecular Analysis of Transdifferentiation[J].Exp Cell Res 1998;245(2):245-251.
[14] Iio A, Mochii M, Agata K, Kodama R, Eguchi G. Expression of the retine pigmented epithelial cell-specific pP334 gene during development of the chicken eye and identification of its product[J].Dev Growth Differ 1994;36:155- 164.
[15] Brundereef GA, van Genesen ST, Destree OHJ, Lubsen NH. Extra lenticular expression of Xenopus laevis α-,β-,and γ-crystalline gene[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1997; 38: 2764-2771.
[16] Baird A, Leonharddt H, Hinterberger TJ. Fibroblast growth factors [J].Br Med Bull 1989;45:438-445.
[17] Gospodarowicz O, Katner N, Callaerts P. The role of the fibroblast growth factor in the proliferation response of the cornae and lens epithelium[J].Exp Eye Res 1977;25: 631.
[18] Del Rio-Tosnis K, Jang JC, Chiu IM, Tsonis PA. Conservation of fibroblast growth factor function in lens regeneration[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:13701-13706.
[19] Del Rio-Tosnis K, Trombley MT, McMahon G, Tsonis A. Regulation of lens regeneration by fibroblast growth factor receptor 1[J]. Dev Dyn 1998;213:140-146.
[20] Jung JC, Del Rio-Tosnis K, Tsonis PA. Regulation of homeobox-containing gene during lens regeneration[J].Exp Eye Res 1998;66(3):361-370.
[21] Papalopoulou N, Kintner C. A Xenopus gene, Xbr1, defines a novel class of homeobox gene.and is expressed in the dorsal ciliary margin of the eye [J].Dev BIOL 1996;174:104-114.
[22] Oliver G, Mailhos A, Wehr R, Copeland NG, Jenkins NA, Gruss P. Sir 3, a murine homologue of the sine oculis gene, demarcates the most anterior border of the developing neural plate and is expressed during eye development[J]. Development 1995; 121: 4045-4055.
[23] Grainger RM. New perspective on embryonic lens induction[J]. Sem cell Dev Bid 1996;7:149-155.
[24] Macdonalol R, Wilson SW. Distribution of Pax-6 protein during eye development suggests discrete roles in proliferative and differentiated visual cells[J].Dev Genes Evol 1997;206:363-369.
[25] Mizuno N, Mochii M, Takamasa S, Ysmsmoto TC, Takahashi GE, Okada TS. Pax-6 and prox-1 expression during lens regeneration from cynops iris and Xenopus cornea:evidence for a qenetic program common to embryonic lens development [J]. Development 1999;l65(3):141-149.
[26].Berbers GA, Hoekman WA, Bloemendal H, de Jong WW, Kleinschmidt T, Brauniter G, Proline-and. alanine-rich N-terminal extension of the basic bovine beta- crystallin B1,Chain[J]. FEBS Lett 1983;161: 225- 229.
[27] Hejtmancik JF, Thompson MA, Wistow G, Pitatigorsky J. cDNA and deduced protein sequence for βB1-crystallin polypeptide of the chicken lens. J Biol Chem 1986;261:982-987.
[28] Marktantova IuV, Luk’ianov KA, Kazanskaia OV, Mitashov VI, Luk’ianov SA. An analysis or expression of the containing the LeR-1 and VeR-1 sequence in the embryogenesis, regeneration and in the intact tissues of newts[J]. Ontogenez 1997;28(4): 262-270.
[29] Okamoto M. Induction of ocular tumor by nickel subsulfide in the Japanese common newt.Cynops pyrrhogaster[J].Cancer Res 1987; 47: 5213-5217.
[30] Okamoto M. simultaneous of lens regeneration from dorsal iris and tumor production from ventral iris in the same newt eye after carcinogen administration[J].Diffreentiation 1997;61:285-292.
[31] Ikai C, Okamoto M. Reduced Macrophage Phagocytic Activity in Wolffian lens regeneration of the newt after Nickel subsufide administration[J]. Comp Biochem Physiol 1998; 119:81-88.
[32] Tsonis PA, Trombley MT, Rowland T, Chandraratna RA, Del Rio-Tosnis K. Role of retinoic acid in lens regeneration[J]. Dev Dyn 2000;219(4):588-593.
[33] Filoni S, Bernardini S, Sannata SM, D’A lessio A. lens regeneration in varval Xenopus laevis: experimental anylysis of the decline in the regenerative capacity during development[J].Dev Biol 1997;187(1):13-24.